Онкология: мир на пороге научной революции?

Страницы журнала Nature (№464 за 2010 г.)

Можно сказать, все началось с одной опухоли и одного гена. В 2006 г. в исследовании 35 разновидностей колоректального рака было обнаружено, что в ДНК, выделенной из биопсии одной из опухолей, присутствует мутация в гене IDH1 [1]. Тогда ученым показалось, что обнаруженная мутация не слишком значима, так как при анализе еще 300 образцов колоректальных опухолей она более ни разу не проявилась. При мутации в гене IDH1 происходила замена всего одного нуклеотида, что приводило к нарушению структуры белкового продукта гена – фермента изоцитрат-дегидрогеназы, участвующей в процессах метаболизма. Следует сказать, что этот фермент присутствует в клетке в крайне небольшом количестве, и при наличии мутаций еще в 13 000 генов, проанализированных для каждого образца опухолей, на него попросту не обратили внимания. «Никто не ожидал, что именно ген IDH1 окажется столь важным для процесса канцерогенеза», прокомментировал ситуацию онколог Виктор Велкулеску (Victor Velculescu) из Университета Джона Хопкинса (John Hopkins University), участвовавший в этом исследовании.

С углублением исследований в области генетики онкологических заболеваний мутация в гене IDH1 вновь попала в поле зрения ученых: она обнаруживалась в 12% образцов злокачественной опухоли мозга – глиобластомы (glioblastoma multiforme) [2], а также в 8% образцов, полученных от пациентов с острым миелолейкозом (одна из разновидностей рака крови) [3]. Структурные изменения в кодируемом IDH1 белке приводят к изменению его ферментативной активности, из-за чего в клетках начинает накапливаться канцерогенный метаболит [4]. На сегодняшний день уже по крайней мере одна фармацевтическая компания – Agios Pharmaceuticals - начала инвестировать средства в разработку препарата, который мог бы остановить этот процесс.

В последние два года в лабораториях всего мира был прочитан геном тысяч образцов различных опухолей, а также здоровых клеток, полученных от тех же пациентов. На сегодняшний день опубликованы данные о геномах примерно 75 типов злокачественных опухолей, а в течение еще одного года ожидается получить данные по нескольким сотням опухолей.


Результат анализа генома злокачественной клетки. Цветные линии показывают, какие структурные перестройки произошли в ДНК. Внешнее кольцо представляет собой проанализированные хромосомы, а на внутреннем отмечено расположение различных мутаций.
(рисунок из статьи M.R. Stratton, P.J. Campbell, P.A. Futreal)

В своей работе ученые сталкиваются с массой препятствий технического характера. Сравнение геномов раковых и нормальных клеток приводит к обнаружению массы различных точечных мутаций, а также других нарушений структуры генов: делеций, инсерций, инверсий, дупликаций и т.д. Сложность состоит в том, что среди всех этих мутаций нужно выделить те, которые действительно имеют значение для канцерогенеза. Создание каталога всех мутаций, встречающихся в опухолях, приведет к накоплению массы ненужной информации.

Некоторые опухоли, будучи весьма схожими по своим клиническим признакам, могут существенно различаться генетически. При этом среди мутаций можно всегда выделить те, которые инициируют рак, и те, которые возникают уже в процессе озлокачествления клетки, являясь «побочными продуктами» канцерогенеза. Можно искать инициирующие мутации, выявляя мутации, повторяющиеся в опухолях различных тканей, а можно применить более сложный подход, идентифицируя ключевые молекулярные сигнальные пути, нарушенные в различных опухолях, и составляя «карты» мутаций, приводящих к этим нарушениям. К сожалению, проект пока ставит больше вопросов, чем дает ответов. «Некоторые мутации со всей очевидностью являются инициирующими рак, но как быть с остальными? – спрашивает Уилл Парсонс (Will Parsons), онколог из Бэйлорского Медицинского Колледжа (Baylor College of Medicine), - как решить, для каких мутаций проводить функциональный анализ? Вот это действительно сложно».

Найти инициаторов!


Страны, принявшие участие в грандиозном проекте.

Поскольку рак – заболевание, неразрывно связанное с нарушениями структуры ДНК, многие считают, что исследования нужно проводить по принципу проекта «Геном Человека» (Human Genome Project). Международный Консорциум по Изучению Ракового Генома (International Cancer Genome Consortium, ICGC), организованный в 2008 г., занимается координацией исследований, в которых предполагается прочитать геномы 50 различных онкологических заболеваний. Для каждого из типов рака предполагается проанализировать по 500 образцов опухолей. Стоимость этих исследований составит примерно один миллиард долларов США. Исследовательские центры 11 стран уже подписали соглашение о вступлении в проект, планируя прочитать геномы 20 онкологических заболеваний.

ICGC включил в себя два более ранних масштабных проекта – проект «Геном Рака» (Cancer Genome Project), проводящийся в Wellcome Trust Sanger Institute в Кембридже (Великобритания), и «Атлас Ракового Генома» (Cancer Genome Atlas, TCGA), финансируемый Национальными Институтами Здоровья США (National Institutes of Health). В проекте «Геном Рака» уже проведен анализ более чем 100 неполных геномов и 15 полных геномов опухолей, а в следующие 5-7 лет планируется проанализировать еще от 2 до 3 тысяч геномов. Проект «Атлас Ракового Генома» нацелен на анализ более чем 20 типов рака (по 500 образцов опухолей от каждого) в ближайшие 5 лет.

Несмотря на сотрудничество английской и американской групп, до настоящего времени не произошло их окончательного объединения из-за разницы в законодательствах двух стран, регулирующих правила доступа к информации о геномах. Сейчас ученые, принимающие участие в проектах, объединили свои усилия для параллельного изучения одних и тех же образцов, полученных примерно из 100 опухолей – если такая параллельная работа окажется эффективной и позволит исключить ошибки в прочтении геномов, то она будет продолжена.

Чем больше образцов различных типов онкологических заболеваний будет проанализировано, тем больше вероятность обнаружить и охарактеризовать мутации, подобные мутации гена IDH1, что поможет в разработке новых терапевтических стратегий. Если в большинстве образцов опухолей одного типа постоянно встречается одна и та же мутация в определенном гене, то, по всей видимости, именно она является инициирующей для данного типа рака. Такой подход уже показал свою эффективность для некоторых опухолей: например, доказано, что 12% случаев глиобластомы вызвано мутацией IDH1. С другой стороны, глиобластома – очень гетерогенный в генетическом отношении рак, и для других опухолей ситуация может оказаться несколько проще. Полный анализ генома опухолевых клеток при остром миелолейкозе выявил всего 10 мутаций в белок-кодирующих генах, 8 из которых ранее не ассоциировались с онкологией [5].

С другими опухолями ситуация, наоборот, оказывается намного сложнее. Например, значимость мутации в гене IDH1 стала ясной только после того, как было проанализировано множество опухолей, а для колоректального рака, в котором эта мутация была впервые обнаружена, она оказалась не столь важной. Некоторые мутации, приводящие к развитию опухоли, встречаются с крайне низкой частотой – например, менее чем в 1% злокачественных новообразований. Для того, чтобы их обнаружить, нужно провести доскональный анализ геномов из 500 образцов одного типа рака – такие мутации могут встретиться менее, чем в 3% образцов. Это не делает их менее «важными» - с точки зрения фундаментальной науки, они необходимы для создания полного представления о генетике рака; с точки зрения клиники, необходима разработка препаратов в том числе и против редких разновидностей той или иной опухоли, поскольку именно такие препараты смогут спасти жизни пациентов, для которых на сегодняшний день нет эффективной терапии.

Другой популярный среди исследователей подход – искать мутации в генах, кодирующих белки, участвующие в одном молекулярном сигнальном пути, контролирующие некий определенный метаболический процесс в клетке. Даже если мутации нарушают одновременно разные элементы одного процесса, их можно объединять по функциональному признаку, что помогает систематизировать информацию. Например, при анализе 24 образцов опухолей поджелудочной железы было обнаружено, что в клетках нарушается сразу 12 метаболических путей, что вызвано определенным набором мутаций в геноме [6]. Однако этот исследовательский подход также не однозначен: многие метаболические пути перекрываются, дублируют друг друга, их «границы» размыты и нечетки. Данные о разных путях сигналинга могли быть в разное время получены на разных экспериментальных объектах (клетках разных животных), и не всегда обнаруживаются в клетках человека. Более того, в раковых клетках сигнальный путь может быть изменен настолько сильно, что его оказывается крайне сложно соотнести с процессом, протекающим в здоровой клетке.

Сколько же геномов нужно изучить?


Несколько примеров полностью и частично прочитанных геномов злокачественных опухолей и их характеристики.

Отделить значимые мутации от незначимых станет еще сложнее, когда исследователи приступят к анализу геномов целиком, а не только генов, кодирующих белки (т.н. экзома, который составляет всего лишь 1,5% всей ДНК клетки). На сегодняшний день только для немногих типов рака получены полные генетические последовательности. Нельзя забывать, что мутации в различных регуляторных последовательностях ДНК могут быть не менее драматичны для клетки, чем нарушение структуры белков. В то же время, анализировать генетические последовательности белков дешевле и, что еще более важно, гораздо проще интерпретировать, ведь функции большинства не кодирующих белки участков генома до сих пор остаются неизученными. Большинство же мутаций приходится именно на белок-некодирующие последовательности. Например, полное секвенирование генома одной из клеточных линий мелкоклеточного рака легких позволило обнаружить 22 910 точечных мутаций, лишь 134 из которых приходились на белок-кодирующие участки [7]. При этом высока вероятность того, что ни одна из этих 134 мутаций не является инициировавшей рак.

Многие исследователи считают, что цена проекта слишком высока и превосходит пользу, которую можно извлечь из его результатов. Их коллеги, например, генетик и онколог Ари Мелник (Ari Melnick) из Медицинского Колледжа Вэйла Корнелла (Weill Cornell Medical College) в Нью-Йорке, утверждают, что в ближайшие несколько лет благодаря новым технологиям секвенирования ДНК стоимость работ значительно снизится. Пока этого не произошло, необходимо, по мнению генетика Стивена Элледжа (Stephen Elledge) из Гарвардской Медицинской Школы (Harvard Medical School), заняться исследованиями в несколько ином направлении: например, изучить мутации, приводящие к увеличению количества копий определенных генов в геноме. Такие мутации проще обнаружить, и, в то же время, они нередко становятся причиной озлокачествления клеток. Разрабатывать препараты, направленные на исправление последствий таких нарушений, также несколько проще, поскольку в данном случае требуется просто «выключить» часть работающих копий гена. Технологии такого «выключения» сегодня уже достаточно хорошо разработаны. Обратная ситуация, связанная с уменьшением нормального количества копий гена в ДНК, также может быть исследована и принести эффективные результаты уже сегодня, поскольку существуют подходы к искусственной амплификации генов и внесению их в клетку. Исправлять же последствия точечных мутаций в генах в данное время гораздо сложнее и, что немаловажно, поиск таких подходов обходится гораздо дороже.

Выявить изменение количества копий того или иного гена и некоторые мутации можно с помощью относительно грубого метода, основанного на применении ДНК-микрочипов (microarray), однако секвенирование ДНК может дать гораздо более полную и точную информацию о нарушениях, произошедших в геноме. Из-за этого некоторые исследователи, невзирая на высокую стоимость технологий секвенирования, предпочитают точное картирование всех инсерций и делеций, а также других мутаций, которые не удается выявить с помощью microarray. Научная группа под руководством Эллайн Мардис (Ellaine Mardis), специалиста по секвенированию из Университета Вашингтона (Washington University), применила секвенирование для выявления повторяющихся делеций в ДНК клеток метастазирующего рака молочной железы [9]. Во всех образцах была обнаружена делеция в гене CTNNA1 – по всей видимости, белковый продукт именно этого гена препятствует метастазированию опухоли.

Исследователи не хотят ждать, когда цены на секвенирование снизятся, поскольку понимают, что настоящая работа по анализу полученных данных начнется, когда секвенирование множества геномов будет уже проведено, а это займет длительное время. Чтобы результаты грандиозного проекта по анализу генома злокачественных опухолей не пропали даром и были применены для разработки новых терапевтических стратегий, исследователям неизбежно придется провести множество экспериментов, выявив фундаментальные биологические закономерности, лежащие в основе процесса канцерогенеза.

Понимая это, руководство Национального Института Исследований Рака США (National Cancer Institute) объявило, что с сентября 2010 г. начнется двухгодичный проект, направленный на разработку высокоэффективных методов анализа мутаций, информация о которых была получена в результате выполнения проекта «Атлас Ракового Генома». Необходимо понять, каким образом каждая из обнаруженных мутаций влияет на поведение клетки. В этом двухгодичном «функциональном» проекте примут участия два американских центра: Центр Рака «Дана-Фарбер» в Бостоне (Dana-Farber Cancer Center) и Лаборатория в Колд Спринг Харбор в Нью-Йорке (Cold Spring Harbor Laboratory). Научная группа в Бостоне займется экспериментами по амплификации и, наоборот, по подавлению экспрессии генов, в которых были обнаружены мутации, чтобы выявить, как усиление или подавление функции того или иного гена влияет на состояние клетки в культуре и происходят ли при этом процессы, ведущие к озлокачествлению клеток. Ученые из Колд Спринг Харбор планируют получить клетки с различными типами мутаций и трансплантировать их мышам с индуцированным иммунодефицитом. Это позволит узнать, какие именно мутации должны присутствовать в клетке, чтобы появилась вероятность развития опухоли в живом организме.

Помимо исследований опухолей человека, параллельно планируется оценить делеции каждого из генов, в которых были обнаружены мутации, в геноме мыши, чтобы получить более полную информацию о работе этих генов у млекопитающих и оценить, до какой степени данные, полученные в работах на мышах, можно экстраполировать на человека.

Литература:
1. Sjoblom T. et al. Science 2006; 314: 268-274.
2. Parsons D.W. et al. Science 2008; 321: 1807-1812.
3. Mardis E.R. et al. N. Engl. J. Med. 2009; 361: 1058-1066.
4. Dang L. et al. Nature 2009; 462: 739-744.
5. Ley T.J. et al. Nature 2008; 456: 66-72.
6. Jones S. et al. Science 2008; 321: 1801-1806.
7. Pleasance E.D. et al. Nature 2010; 463: 184-190.
8. Ding L. et al. Nature 2010; 464: 999-1005.

По материалам:
NatureNews