Геномика и биотехнология: наука начала третьего тысячелетия

С.А. Боринская, кандидат биологических наук
Институт общей генетики РАМН им. Н.И. Вавилова

К успехам биологии конца XX века, символизирующим прогресс науки, относятся открытия, ставшие научными сенсациями и привлекшие внимание прессы и общества: расшифрована последовательность нуклеотидов всего генома человека; открыты гены, связанные с рядом заболеваний; понимание молекулярных основ развития заболеваний привело к созданию новых методов их лечения и профилактики, разработаны генодиагностика и генотерапия; получены трансгенные животные и растения, то есть такие организмы, в геном которых по желанию исследователя введены чужеродные гены; осуществлено клонирование животных.

Это лишь некоторые достижения, и они стали возможными благодаря созданию совершенно новых технологий манипулирования с генетическим материалом, что привело к открытиям, которые повлияли на наши представления о природе живого и общем развитии жизни на Земле, и человека в том числе. Отношение к новым технологиям и научным открытиям неоднозначно — они порождают и большие надежды, и серьезные опасения. Например, программу «Геном человека» — самый крупный в истории науки биологический научный проект, называют то гигантским научным прорывом, то чисто коммерческой акцией, не имеющей практического значения для большинства людей. В чем же смысл полученной информации и чем она может быть полезна обществу в целом? Какие новые знания стали доступными? Когда можно ожидать практическую отдачу от вложенных в науку средств?

Краткую историю открытий, заложивших основу генного бума, можно начать с модели двуспиральной структуры ДНК, созданной в 1953 г. Д. Уотсоном и Ф. Криком на основе рентгенограмм, полученных Р. Франклин. В 1961 г. С. Бреннер и Ф. Жакоб выясняют роль мРНК, а к концу 60-х усилиями нескольких групп ученых расшифрован универсальный генетический код — созданный природой «словарь» перевода последовательности нуклеотидов РНК в последовательность аминокислот синтезирующегося белка. В 1970 г. работы В. Арбера и Г. Смита приводят к открытию ферментов-рестриктаз, которые разрезают ДНК в строго определенных участках. С помощью рестриктаз из протяженных молекул ДНК начинают вырезать относительно небольшие интересующие исследователя фрагменты. В 1973 г. рождается генная инженерия: С. Коэн, Э. Чанг и Г. Бойер создают первую гибридную молекулу ДНК: они соединяют два фрагмента ДНК, выделенных из разных организмов. Теперь ученые умеют по своему усмотрению резать и сшивать «молекулу жизни». Разработаны процедуры размножения искусственно получаемых молекул ДНК в клетках бактерий и дрожжей. В 1970 г. создаются основные молекулярные технологии. Разрабатываются методы секвенирования — определения последовательности нуклеотидов в ДНК (Ф. Сенгер, А. Максам и В. Гилберт), а также искусственного синтеза олигонуклетидов — коротких цепочек ДНК, содержащих несколько десятков звеньев (Г. Корана), и пептидов (Б. Меррифилд). Теперь компоненты живой клетки — ДНК и белки (в том числе используемые как лекарства) — можно синтезировать на заказ.

Генные технологии получают мощное ускорение с изобретением К. Мюллисом в середине 80-х гг. полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей за пару часов нарабатывать в больших количествах заданный фрагмент ДНК. Принцип реакции настолько прост, что генетики удивляются, почему это не пришло кому-нибудь в голову раньше, ведь все компоненты ПЦР были известны уже более десятка лет. ПЦР быстро получила очень широкое применение — от передовых научных исследований до ставших рутинными клинических анализов, устанавливающих наличие болезнетворных мутаций в ДНК человека или присутствие возбудителей различных инфекций в его организме. ПЦР-диагностика заболеваний, передающихся половым путем, занимает самую большую долю рынка генных услуг. Особенно важным стало появление ПЦР в диагностике туберкулеза. Поскольку туберкулезные бактерии растут очень медленно, выявление их традиционными бактериологическими методами продолжалось до месяца. Новые технологии позволяют установить наличие возбудителя и даже его устойчивость или чувствительность к антибиотикам за несколько часов.

За многими открытиями стоит настойчивость и научное предвидение, но некоторые появились благодаря случайным удачам и озарениям. Так, Ниренберг и Маттеи использовали при попытках расшифровать генетический код сложные реакции, добавляя в некоторые пробирки вещества, которые, по представлениям того времени, не должны были стимулировать необходимый им синтез. Но именно в этих пробирках прошла ключевая реакция, давшая основу дальнейшей быстрой расшифровке кода. Полимеразная цепная реакция, позволяющая нарабатывать большие количества заданных фрагментов ДНК, была придумана Мюллисом случайно, когда он пытался создать новую технологию совсем для других целей. Практически все вехи этого пути отмечены Нобелевскими премиями. Наука очень быстро проходит путь от кажущихся фантастическими предположений ученых к открытиям и техническим решениям, выходящим за стены лабораторий и становящимся частью повседневной жизни.

Программа «Геном человека». Совершенно фантастической казалась в конце 80-х гг. высказанная Уотсоном мысль о возможности расшифровки всей генетической информации (генома) человека. Критики считали, что решение этой задачи технически нереально и потребует непосильных затрат. Однако благодаря научной репутации и авторитету Джеймса Уотсона в 1988 г. в США был начат проект «Геном человека», сначала возглавляемый Уотсоном, а позже сменившим его Френсисом Коллинзом. В цели проекта входило создание полной карты геномы человека, а затем его полное секвенирование.

В 1989 г. по инициативе академика А.А. Баева, поддержанной М.С. Горбачевым, был открыт российский проект «Геном человека». Россия стала второй страной, в которой появился такой государственный проект. Национальные программы изучения геномов возникли более чем в 20 странах (в Великобритании, Германии, Франции, Японии, Китае и др.). Работа шести наиболее крупных проектов координируется организацией «Геном человека» (The Human Genome Organization, сокращенно HUGO), сформированной в 1988 г. на первой конференции по картированию и секвенированию генома человека в Колд Спринг Харборе. Стартовый объем годового государственного финансирования проекта в США и России исчислялся в 30 и 10 млн. долл. соответственно. К завершению первого этапа в 2001 г. объем государственного финансирования программы составил в США около 300 млн. долл. (и не меньшие суммы вкладывались в исследования коммерческими организациями), а в России — не превышал 300 тыс. долл. В 2000- 2001 гг. было объявлено, что цель первого этапа проекта «Геном человека» достигнута — прочтена полная последовательность нуклеотидов.

Геном человека состоит из 3 млрд. нуклеотидов. Чтобы только пробежать глазами текст такого размера, потребовалось бы 70 лет (миллиард секунд). Секвенирование ДНК за 30 лет превратилось из уникальной лабораторной методики в промышленный процесс, а центры секвенирования похожи на заводы, оснащенные сотнями автоматизированных машин. Секвенирован геном не только человека, но и животных, растений и бактерий. Новое направление науки, изучающей целые геномы, получило название геномики. Фармацевтические компании вкладывают огромные средства в эти работы, так как знание молекулярных основ развития живых организмов в норме и при патологии позволяет разработать принципиально новые подходы к лечению и профилактике заболеваний.

Полученная при расшифровке генома человека информация уже сейчас привела к созданию систем диагностики нескольких сотен наследственных заболеваний. Еще 20 лет назад для большинства из них в справочниках указывалось «исходное нарушение, приводящее к развитию заболевания, неизвестно». Понимание закономерностей работы генов помогает устанавливать наличие заболевания еще до проявления симптомов. Во многих случаях раннее профилактическое лечение позволяет предотвратить развитие заболевания или отодвинуть начало его проявления. Диагностику проводят даже до рождения ребенка. Для этого на ранних сроках беременности отбирают небольшое количество околоплодной жидкости, содержащей клетки плода. Затем определяют, имеются ли нарушения в генетическом материале этих клеток и присутствуют ли в нем болезнетворные мутации. Такая диагностика может быть проведена и при экстра-корпоральном оплодотворении, еще до помещения полученного in vitro зародыша в матку — она называется преимплантационной.

Десятки систем генодиагностики для наиболее распространенных заболеваний, таких как болезнь Дауна, фенилкетонурия и муковисцидоз, введены в практику медико-генетического консультирования. Это привело к значительному снижению частоты рождения детей, обреченных на неизбежную мучительную смерть от некоторых заболеваний. При выявлении генетических нарушений у плода врач предоставляет информацию о возможных рисках, но только родители могут принять решение о прерывании беременности и предотвращении рождения больного ребенка. Появление новых методов сделало необходимым обсуждение этических проблем и принятие законов, защищающих права и достоинство человека, в том числе и в эмбриональном состоянии. В дискуссиях участвуют медики и генетики, представители общественных организаций, религиозные деятели, юристы, философы, специалисты по этике.

Разрабатывается новый метод лечения — генная терапия. Больным с генными нарушениями вводят генетический материал, который должен компенсировать исходный дефект. Метод еще далек от широкого внедрения, но уже известны положительные результаты лечения. В 1990 г. американский генетик Андерсон успешно применил генную терапию для лечения девочки с тяжелыми врожденными нарушениями иммунитета. Значительное внимание привлекают исследования по генетике рака. Рак может возникать как под воздействием внешних причин (канцерогенов или вирусов), так и при повреждении генетического аппарата клетки. Найдены гены, мутации в которых повышают риск развития злокачественных преобразований, в частности, рака груди. Это позволило диагностировать предрасположенность к развитию некоторых форм рака. При лечении онкологических заболеваний может быть эффективной генотерапия, разрабатываются и другие направления — например, получение вакцин против рака. В 2001 г. начаты испытания вакцины, предотвращающей заражение папилломавирусом — одним из основных агентов, вызывающих рак шейки матки. Если они пройдут успешно, в ближайшие годы будет получена вакцина против формы рака, второй по распространенности среди 20-30-летних женщин.

Оказалось, что от наследственных особенностей человека зависит и переработка поступающих извне веществ, таких как лекарственные препараты или продукты питания. Этим процессом заведуют так называемые «гены внешней среды». Сочетание определенных вариантов генов у человека может влиять на эффективность лечению некоторыми препаратами или реакцию на токсины. Так, у женщин с определенными сочетаниями мутаций риск развития рака груди при курении может повышаться в десятки раз. Другой пример — различия в тяжести поражения людей при атаке отравляющим газом в токийском метро в значительной мере объясняются причинами генетического характера. Генетическое тестирование может быть полезным при выборе профессии. Например, давно известна связь между анилиновыми красителями и риском возникновения рака мочевого пузыря. Недавно, однако, было установлено, что такому грозному «производственному» осложнению особенно подвержены индивидуумы с определенными вариантами генов, контролирующих детоксикацию чужеродных веществ в организме.

Бактерии и геномика. Для медицины важны геномные исследования не только человека, но и других организмов, в первую очередь — бактерий. Бактерии имеют очень небольшой по сравнению с человеком геном, и на них отрабатывались многие генные технологии. Геном первой бактерии — гемофильной палочки — секвенирован в 1995 г. В этой работе была опробована методика, предложенная К. Вентерем и использованная им впоследствии при расшифровке генома человека. Анализ структуры геномов бактерий дал множество ценной информации — как теоретической, открывающей закономерности функционирования живого, так и практической, используемой в биотехнологии и медицине. Например, установлено минимальное число генов, необходимых для поддержания жизни клетки в оптимальных условиях — немногим более 250. У самой мелкой известной бактерии 500 генов, тогда как у большинства — от 1 до 4 тыс.

Расшифровка геномов болезнетворных бактерий позволяет выявить свойственные отдельным их видам особенности метаболизма и разработать антибиотики, прицельно действующие именно на данную бактерию, не затрагивая человека и его нормальную микрофлору, что позволит избежать осложнений. Восприимчивость или устойчивость человека к инфекциям также зависит от того, какие у него гены. Так, найдены мутации, предотвращающие заражение вирусом иммунодефицита человека или значительно замедляющие развитие СПИДа в случае инфицирования.

Сравнительная и функциональная геномика. У человека, как установлено по полной нуклеотидной последовательности его генома, около 30-40 тыс. генов. Устроены они гораздо сложнее, чем бактериальные. В генах у человека (как и у других сложных животных) записана программа развития от первого деления зародышевой клетки до последнего вздоха человека на его жизненном пути. Судьба каждой клетки — станет ли она клеткой эпителия или превратится в нервную клетку, лейкоцит или эритроцит — определяется тем, какие группы генов работают в ней. Большая часть генов в клетке обычно бездействует. Они выключены, и чтобы они начали работать, необходимы специальные сигналы.

В норме последовательное включение и выключение групп генов в разных клетках происходит удивительно согласованно — будто ими управляет невидимый дирижер: в каждой клетке как бы «звучит» свой аккорд генов, и их работа определяет специфичность клетки. Гены-дирижеры, подающие сигналы остальным, называют мастер-генами, «генами-начальниками». В изучении изменения активности генов в процессе развития получены интересные результаты на модельных животных, геномы которых уже секвенированы (муха дрозофила, круглый червь нематода, мышь). Так, показано, что найденный у человека ген, связанный с развитием речи, очень похож на мышиный ген, работающий на одном из этапов эмбрионального развития и участвующий в формировании головного мозга. Эксперименты на мышах позволили предположить, что у человека этот ген выполнят сходные функции, а мутации в нем нарушают нормальное развитие мозга. Задачи «постгеномной эры», вставшие перед учеными после расшифровки нуклеотидных последовательностей полных геномов, — установление полных наборов синтезируемых в различных клетках и тканях молекул РНК, соответствующих им белков и катализируемых ими биохимических реакций. Предполагается, что решению этих задач будут посвящены ближайшие десятилетия.

ДНК-идентификация в судебной практике. Результаты исследования генома человека применяются не только в медицине, но и в других областях, например при ДНК-идентификации личности и установлении родства по ДНК. В криминалистике они служат для идентификации участников преступления по биологическим следам, найденным на месте преступления или у подозреваемого. Начало этому направлению положили работы А. Джеффриса, показавшего, что ДНК каждого человека имеет уникальные особенности, по которым можно узнать, принадлежат ли ему биологические образцы (волосы, частички кожи, f кровь, слюна, сперма). Метод, названный «ДНК-фингерпринт», впервые был применен в Англии при изобличении убийцы двух 15-летних девочек.

Основанный на аналогичных принципах метод определения родства по ДНК позволяет устанавливать отцовство (нередкая процедура в гражданских исках) или другие кровнородственные отношения между людьми. Сейчас анализ ДНК применяется для криминалистической и судебной экспертизы во всем мире. Так, в Великобритании создана национальная база данных результатов ДНК-тестирования. В случае ареста подозреваемого у него берут пробы ДНК — аналогично тому, как это уже давно делается с отпечатками пальцев — и заносят результаты теста в компьютерную базу данных. В базе данных Великобритании хранится описание сотен тысяч проб ДНК. Их использовали в расследовании десятков тысяч криминальных случаев. Так как значительная часть преступлений со| вершается рецидивистами, наличие такой базы помогает установить личность возможного преступника по биологическим образцам, обнаруживаемым на месте преступления. К методам ДНК-идентификации и установления родства прибегали при идентификации останков семьи российского императора Николая II, в деле президента Клинтона и Моники Левински, в других громких делах. В США созданы базы данных для ДНК-идентификации военнослужащих — опознание личности по ДНК надежнее, чем по привязанному к руке жетону.

История человечества в ДНК. Сходство генетических характеристик позволяет устанавливать родство не только между отдельными людьми, но и между целыми этническими группами. На основе генетического разнообразия популяций мира реконструируется история формирования отдельных народов и человека как биологического вида в целом. Исследования ДНК в сочетании с данными археологии, этнографии, истории, лингвистики, помогают датировать события популяционной истории человечества. В споре генетиков, пришедших к выводу, что современный человек возник в Африке и затем расселился по всему земному шару, с приверженцами распространенной ранее концепции мультирегионального происхождения, предполагающей, что наш предковый вид Homo erectus (человек прямоходящий) превратился в Homo sapiens независимо в нескольких регионах мира, исследования ДНК предоставили решающие аргументы и позволили реконструировать основные этапы развития событий.

Некоторое время наши предки в Европе соседствовали с неандертальцами, вымершими около 30 тыс. лет назад. Генетику С. Пэбо первому удалось выделить ДНК из костных останков неандертальцев. Сравнение древних образцов с ДНК современных людей показало, что неандерталец составлял отдельный, хотя и близкородственный человеку, вид. Генетических следов смешения предков современного человека и неандертальцев (если таковое происходило) не осталось. Данные о разнообразии ДНК используются и для изучения распространения культуры, технологий и языков в истории человечества. При этом иногда они подтверждают предания и легенды. Анализ ДНК коэнов — иудейских священнослужителей, согласно традиции, являющихся потомками Авраама, показал, что многие из них действительно происходят от общего предка по мужской линии, жившего 2600-3200 лет назад. Интересно, что молекулярно-генетическая датировка этого события совпала с совершенно независимой лингвистической датировкой(3200-3300 лет назад) отделения древнееврейского от ближайших родственных ему языков. Все упомянутые выше исследования связаны с накоплением гигантских массивов информации о структуре нуклеиновых кислот и белков. Ее обработка была бы невозможной без развития методов компьютерного анализа этой информации.

Стремительно развивается и приборное обеспечение биотехнологических работ. К наиболее ярким достижениям относятся биологические микрочипы, разработанные для проведения биологических или химических анализов большого числа образцов (десятков и сотен тысяч) одновременно по нескольким параметрам. В них сочетаются новейшие достижения автоматизации и миниатюризации техники с подходами биотехнологии. Первый в мире патент на создание так называемого микроматричного биочипа был выдан группе российских ученых, возглавляемых А.Д. Мирзабековым. Разработка идеологии и техническое воплощение микроустройств для серийных анализов относятся к 1990 годам. Некоторые чипы обладают аналитическими возможностями хорошо оборудованной лаборатории, а размер их — не больше ладони. Созданы микрочипы разных типов для проведения мониторинга загрязнений окружающей среды, выявления возбудителей инфекционных заболеваний в образцах, полученных от пациентов или из окружающей среды (в том числе — позволяющие за 30 мин. установить факт применения бактериологического оружия), а также устройства для быстрого обнаружения наркотических и лекарственных средств в крови человека. При этом сложные анализы, уже применяемые в научных исследованиях, медицине, фармакологии, охране окружающей среды и других областях, может проводить вне специализированной лаборатории персонал, не обязательно высококвалифицированный.

Клонирование: от молекулы до животных. За прошедшие десятилетия биологи научились манипулировать не только генами, но и целыми клетками. Особое внимание привлекает клонирование. Клонирование (от греч. клон — ветвь, побег) — точное воспроизведение того или иного живого объекта в некотором количестве копий. Этим термином обозначают два совершенно разных процесса — клонирование (то есть получение идентичных копий) фрагментов ДНК и клонирование клеток взрослого организма (получение группы клеток с одинаковым генотипом). Клонирование фрагментов ДНК широко используется в молекулярной генетике, так как небольшой фрагмент (размером в сотни или тысячи пар нуклеотидов) гораздо легче изучать, чем целую хромосому. Для этого исследуемый фрагмент ДНК вводят в клетки микроорганизмов. Клонированные фрагменты ДНК применяют в частности в биотехнологии для получения различных продуктов. Например, в бактериальные клетки ввели ген человеческого интерферона — белка, защищающего организм от действия вирусов. Бактерии синтезируют человеческий белок, который необходим в больших количествах для медицинских целей. Раньше интерферон получали из донорской крови.

Эксперименты по клонированию животных впервые осуществили в начале 50-х гг. американские эмбриологи Р. Бриггс и Т. Кинг. Они пересадили ядро зрелой клетки лягушки в яйцеклетку, собственное ядро которой было удалено. В России такие эксперименты проводились несколько раньше Г. Лопашевым, но его результаты не были опубликованы из-за преследования генетиков в сталинское время. Английскому ученому Д. Гердону удалось усовершенствовать методику и добиться того, что из 1-2% яйцеклеток с пересаженным ядром вывелись лягушата. Из остальных яйцеклеток развивались дефектные эмбрионы, некоторые вообще не развивались — слишком велики были повреждения во время операции пересадки ядер. Если можно клонировать лягушку, то почему не попробовать сделать это и на других объектах?

В 1997 г. появилось сенсационное сообщение о том, что в лаборатории Я. Вилмута (Эдинбург, Шотландия) разработан метод клонирования млекопитающих. Объектом экспериментов была овца. Ядро из клетки молочной железы взрослой овцы ввели в овечью яйцеклетку с удаленным ядром и затем активировали ее посредством электрического удара. Развивающиеся зародыши ввели в матку приемной матери, где они могли развиваться до рождения. Из 236 опытов успешным был только один, в результате которого родилась ставшая знаменитой овечка Долли. Позже появились сообщения о клонировании других млекопитающих — коровы, козы, мыши, свиньи. Ученые считают, что технически возможно клонировать и человека, но в этом случае возникают моральные, этические и юридические проблемы. Но даже если удастся осуществить клонирование людей, получить личность, идентичную личности донора ядра, невозможно. Более того, нельзя получить организм, полностью идентичный исходному по своим биологическим свойствам — для этого пришлось бы точно воспроизвести условия развития плода и рождения. А предположения о массовом производстве сверхгениев или сверхпослушных солдат не имеют под собой никаких оснований.

При клонировании может быть реализовано только то, что лежит в границах возможностей человека как биологического вида. Появляющиеся время от времени сообщения о клонировании животных и о якобы успешных попытках клонирования человека (пока никак не доказанные) привлекают огромное внимание широкой публики. Опросы, проведенные в странах Европы фондом Progress Educational Trust, London, UK, показали, что об овечке Долли знают около 90% опрошенных, а об имеющих гораздо большее значение для людей и уже применяемых на практике генодиагностике и генотерапии слышали лишь около 50%. Аналогичные результаты получены в России. Похоже, что клонирование ассоциируется у неспециалистов с чем-то вроде возрождения душ и порождает страхи, подобные высказанным участниками студенческого митинга 1973 г. в Беркли, во время Международного генетического конгресса: студенты обвиняли ученых в попытках клонировать Ленина, Гитлера, Сталина, Мао Цзэдуна. Эти страхи в значительной мере возникают из-за недостатка информации. Для клонирования организмов нужны живые клетки. После смерти целостность ДНК нарушается, и она может послужить для молекулярного клонирования отдельных фрагментов, но никак не для воспроизведения генетически идентичного организма.

Генетически модифицированные растения. Ни одно царство живого не оказалось обделенным вниманием геномики. Не только человек, животные и бактерии подверглись пристальному изучению или попыткам улучшения, но и растения. Важное достижение биотехнологии состоит в создании генетически модифицированных растений, в том числе — содержащих гены из других организмов. Генные манипуляции позволяют быстро получать сорта, адаптированные к определенным климатическим условиям, устойчивые к вредителям, с увеличенными сроками хранения плодов.

Настороженное отношение со стороны потребителей к генетическим модифицированным продуктам отчасти объясняется тем, что они лишь недавно введены в практику и еще не получены результаты долговременных экспериментов (хотя продукты проходят строжайший всесторонний контроль, да и сама технология создания предусматривает их безопасность для человека). Существенную роль играет и недостаточная информированность населения. Уже упоминавшиеся опросы фонда Progress Educational Trust показали, что по крайней мере треть населения считает, что в генетически модифицированных помидорах есть гены, тогда как в обычных помидорах их нет. Особое положение занимают созданные генными методами растения, синтезирующие витамины или лекарственные препараты — их можно прописывать пациентам вместо таблеток. Так, разведение «золотого риса», продуцирующего витамин А, в тех странах, где рис является одним из основных продуктов питания, спасло бы тысячи людей от слепоты, возникающей при дефиците этого витамина.

Прогнозы: будущее медицины — в геномике. По мнению Ф. Коллинза, главы геномных проектов США, через 30-40 лет здравоохранение будет основано на достижениях геномики (что позволит избавиться от рака, диабета, гипертонии), а в качестве лекарств будут выступать генные продукты, соответствующие тем, которые вырабатывает сам организм при борьбе с болезнью. Будут ли гены продаваться в аптеках наряду с микстурами и таблетками, какие неожиданные открытия изменят привычную картину мира — предсказать трудно. Но ясно, что генные технологии уже вошли в жизнь современного человека, и чтобы общество могло воспринять и с пользой для себя применять достижения науки, необходимы образовательные программы и широкое обсуждение правовых и этических вопросов, связанных с различными областями применения геномики и биотехнологии.

«Энергия» 2005, № 10. С.28-34.